寧波高新區(qū)院士路66號創(chuàng)業(yè)大廈427室
微生物檢測技術(shù)包括定量和定性兩方面。定量指產(chǎn)產(chǎn)品中微生物的數(shù)量測定;定性是根據(jù)做生物表現(xiàn)出的各種性狀特征，對物的種類進(jìn)行鑒別。
目前常用的微生物數(shù)量檢測方法主要有傳統(tǒng)平板培養(yǎng)計數(shù)法和快速檢測法， 微生物快速檢測法包括螺旋平板計數(shù)法、濾膜培養(yǎng)法紙片培養(yǎng)計數(shù)法、最近似數(shù)(MPN）測定法、品微憤直接計數(shù)法(涂片法)、阻抗測定法、熒光素酶測定法、輻射測量法、熒光定量PCR法等。
一，螺旋平板計數(shù)法
螺旋平被計數(shù)法實質(zhì)上屬于鑿落計數(shù)法，菌落計數(shù)法是把定量樣品中的微生物經(jīng)稀釋后搜種于固體培養(yǎng)基上，經(jīng)過培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)基上出現(xiàn)的南落數(shù)檢測樣品中微生物含量。
螺旋平板計數(shù)法的基本原理是，接種針將樣品液以阿基米德螺旋方式從平板中間往外連續(xù)稀釋接種，每次接種量約0.05ml.接種于平板中間部分的菌體密度較高，往外則逐漸稀釋，在單一平板上可獲得(1:1)~ (1: 10000）的系列稀釋度。培養(yǎng)后，因平板上每一特定面積的接種量為已知，所以由此部位出現(xiàn)的菌落數(shù)可以估計出原來樣品每克或每毫升的含菌量。
螺旋平板計數(shù)法的優(yōu)點為:①可測定500~ 5000CFU/mL的菌數(shù)。②樣品不需事先稀釋。③不需做2個重復(fù)。④接種速度快，每次接種只需1~2min。⑤培養(yǎng)結(jié)果既可人工計數(shù)也可用激光計數(shù)器計數(shù)。⑥人力與物力的花費成本低(不考慮儀器投資成本)。
⑦測定結(jié)果與傳統(tǒng)方法比較，相關(guān)性高。1984~1985 年，螺旋接種法相繼被美國食品與藥物管理局和美國公共衛(wèi)生協(xié)會推薦為正式的細(xì)菌總數(shù)檢驗法。但是，螺旋接種法也有一些缺點:①設(shè)備投資較高。②含額粒的樣品容易堵塞接種針的微細(xì)孔道(固體樣品均質(zhì)后常有的現(xiàn)象)。③如果每毫升樣品的帶菌量小于數(shù)百個或大于100000個，結(jié)果的準(zhǔn)確性將降低。④對瓊脂平板的表面品質(zhì)要求較高，應(yīng)平整、
無皺縮和無氣泡，否則會影響接種和計數(shù)結(jié)果。
二，濾膜培養(yǎng)法
濾膜培養(yǎng)法，又稱等格過濾法，由加拿大衛(wèi)生福利健康保健研究所早期進(jìn)行研究應(yīng)用。該法的基本原理是，在5c㎡、孔徑為0.45μm的濾膜上，用疏水物質(zhì)橫豎各刻印40條線，將濾膜分為1600個小格，以硫水刻線作為格欄，防止菌落的擴(kuò)散。樣品稀釋液首先通過5μm的前德器過濾，再通過0.45μm濾膜過濾，把樣品液中的細(xì)菌截留在
疏水網(wǎng)膜的小格中，然后根據(jù)所需檢驗菌的特性，將濾膜置于適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24~ 48h,陽性菌落即可通過呈色而顯示，據(jù)此進(jìn)行人工計數(shù)或計數(shù)器計數(shù)。
濾膜培養(yǎng)法 的優(yōu)點是:①能去掉樣品中酸類及其他不利于細(xì)菌生長的可溶性物質(zhì)，并排除其中的一些固體物質(zhì) ，因此有利于菌落的生長和菌落的計數(shù)。②可以濃縮樣品中的細(xì)菌。③便于恢復(fù)受傷細(xì)菌的活力，且不影響檢測結(jié)果。 上述優(yōu)點使濾膜培養(yǎng)法靈敏度高、檢測時間短。
三，紙片培養(yǎng)計數(shù)法
紙片法也叫皿膜法，脫水培養(yǎng)基固化在載體上，含有測試菌生長所需的營養(yǎng)物，還加人了染色劑和顯色劑，增強(qiáng)了菌落的目視效果。與常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)平板培養(yǎng)計數(shù)法相比省去了制備培養(yǎng)基的時間，操作簡便，快速省時，而且可以現(xiàn)場進(jìn)行接種，因此不涉及樣品運(yùn)輸和保存的步驟，能至大限度地保證結(jié)果的真實性，缺點是成本較高，該法適用于物
體表面微生物數(shù)量的檢測。目前應(yīng)用較多的是美國3M公司生產(chǎn)的PtriflmTM?Plates測試片，包括需氧菌平板計數(shù)紙片、大腸菌群紙片、霉菌與酵母菌紙片等，與標(biāo)準(zhǔn)平板培養(yǎng)計數(shù)法進(jìn)行比較，統(tǒng)計結(jié)果表明兩種方法檢驗結(jié)果間的差異無明顯性。國家標(biāo)準(zhǔn)GB14934《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)消毒餐 (飲)具》中規(guī)定檢測餐(飲)具的大腸菌群可以采用紙片法。
四，最近似數(shù)測定法
當(dāng)混勻的樣品通過一系列稀釋和等量分配成為小樣品時，有些小樣品中含樣品量極少，以至其中不再含有需檢驗的細(xì)菌。在一定的小樣品中存在或不存在細(xì)菌，可被用來對原始樣品中的菌數(shù)做統(tǒng)計學(xué)估計。最近似數(shù)(MPN)測定法就是這樣一種將樣品“多次(管)稀釋迄至無菌”的計數(shù)方法。在此方法中，將3個稀釋梯度的檢樣稀釋液接種于9支或15支試管培養(yǎng)基中，每個稀釋度接種3支或5支。經(jīng)培養(yǎng)后，根據(jù)結(jié)果查閱MPN檢索表，就可得到原樣品中微生物的估計數(shù)量。
MPN測定法不是一種精確的分析方法，3個稀釋梯度的95%置信度范圍為21~395。但這一方法仍被普遍應(yīng)用，主要原因是:此方法相對簡單;不同實驗室中得到的實驗結(jié)果與SPC (標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法)相比，相似率較高;使用適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基可檢測特殊的微生物菌群等。
MPN測定法尤其適用于帶菌量極少、其他方法不能檢測的產(chǎn)品。比如水、化妝品、涂料及其他產(chǎn)品中大腸菌群的計數(shù)。在對一個產(chǎn)氣腸桿菌純培養(yǎng)物做計數(shù)時，應(yīng)采用選擇性平板計數(shù)法而不要用MPN測定法。如果待檢樣品是以其他細(xì)菌為主，就應(yīng)選用MPN測定法。
五，顯微鏡直接計數(shù)法(涂片法)
涂片法屬于顯微鏡直接計數(shù)法。在涂片法中，將一定量的食品均勻涂布于載玻片的規(guī)定區(qū)域，進(jìn)行干燥、固定，如必要，需脫脂、染色，用顯微鏡在一 定數(shù)目的視野中計算單個的和成團(tuán)的微生物細(xì)胞數(shù)量，將計算的視野數(shù)目換算成所檢驗食品的量，從而計算出每克或每毫升食品中的細(xì)菌數(shù)。食物涂片法除了廣泛應(yīng)用于鮮奶及其制品的細(xì)菌計數(shù)外，還應(yīng)用于其他產(chǎn)品的微生物檢測，如化妝品、涂料。
這種方法的優(yōu)點是:操作簡便快速;所需設(shè)備少;可以同時鑒定細(xì)胞形態(tài)和革蘭氏染色類型;涂片可保存供以后參考。缺點是:只適于含有大量微生物的產(chǎn)品;由于檢驗的樣品量太少(0.01mL 或0. 001mL)，準(zhǔn)確性受限制;樣品中的碎片影響試驗的準(zhǔn)確性。
六，阻抗測定法
電阻抗是交流電路中導(dǎo)電物質(zhì)對電流所起的阻礙和抵抗作用，可由電導(dǎo)和電容計算出來。微生物可使培養(yǎng)基中的電惰性底物(如糖類、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì))代謝成為電活性產(chǎn)物(如乳酸鹽或氨等)。當(dāng)微生物的生長和代謝活性旺盛時，培養(yǎng)基中的電惰性分子即為許多電活性分子所取代，從而使培養(yǎng)基的電導(dǎo)性增大，培養(yǎng)物的電阻抗降低。如將樣品接種后從開始培養(yǎng)至阻抗值發(fā)生急劇變化的時間稱為檢測時間，則該時間的長短與樣品中的原始菌數(shù)成反比，即原始菌數(shù)越高，檢測時間越短;反之越長。
目前已經(jīng)有根據(jù)上述原理制成的細(xì)菌檢測儀面市，如一種稱為Bactomer的細(xì)菌計數(shù)儀，對細(xì)菌(10000個以上)計數(shù)的準(zhǔn)確率(與標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)比較)在93%以上。該檢測儀由孵育器、一對插入培養(yǎng)基的不銹鋼電極、阻抗監(jiān)測系統(tǒng)和一個微處理機(jī)組成。 據(jù)資料報道，在篩選牛奶樣品時(21C)，用Bactomer可在22h內(nèi)分出含菌大于1000個和小于1000個的樣品，準(zhǔn)確率達(dá)88%;在13.7h內(nèi)區(qū)分出大于100000個和小于100000個的試樣，準(zhǔn)確率達(dá)91%。
七，熒光素酶測定法
三磷酸腺苷(ATP)是所有活細(xì)胞中的主要能量儲藏物，它在細(xì)胞死亡2h后消失。每個細(xì)菌細(xì)胞中的ATP含量恒定，為10（-18）~10（-17）mol。因此通過測定樣品中微生物的ATP量，可以大致估算出樣品所含的總活茵數(shù)。種類或生長期不同的細(xì)菌細(xì)胞中ATP含量有所不同。
目前經(jīng)常利用螢火蟲的熒光素●熒光素酶系統(tǒng)(E-LH2) 檢測細(xì)胞中的ATP。當(dāng)ATP存在時，在Mg2+與O2 參與下，螢火蟲熒光索酶催化螢火蟲熒光素氧化發(fā)光，光強(qiáng)度可用照度計測量。反應(yīng)式如下:
E-LH2十ATP→ELH2 AMP+PPi (焦磷酸)
ELH2AMP+O2→氧化熒光素+ E AMP+ H2O
該反應(yīng)對ATP呈特異性。當(dāng)固定發(fā)光劑于飽和量下時，發(fā)光強(qiáng)度與樣品ATP含量成正比。據(jù)此，可間接計算出樣品中細(xì)菌的總活菌數(shù)。由于該發(fā)光系統(tǒng)的光量子效應(yīng)高，故對ATP的檢測下限可達(dá)1X10(-15)~1X10(-13 )mol/L,相當(dāng)于約1X 100000個活菌數(shù)。
ATP檢測方法可用于快速檢測工業(yè)產(chǎn)品中的微生物，是一種很有潛力的方法。比如紡織品抗細(xì)菌性能和抗真菌性能檢測的標(biāo)準(zhǔn)ISO 13629-1--2014《紡織品 抗真菌性能的測定 第1 部分:熒光法》 。
八，輻射測量法
輻射測量法的原理是細(xì)菌在生長繁殖過程中，可利用培養(yǎng)基中加有14 C標(biāo)記的糖類化合物或鹽類底物代謝產(chǎn)生CO2，然后通過輻射測量儀測量14CO2含量的增加與否，來確定標(biāo)本中有無細(xì)菌的存在。在處理過程中使用50mL有蓋的血清藥瓶，內(nèi)裝12~36mL含已標(biāo)記的可代謝物的培養(yǎng)基。藥瓶中可為好氧條件也可充人氣體形成厭氧條
件，然后接種樣品。藥瓶中的預(yù)留空間可用于檢測CO2的存在。檢測CO2所需的時間與食品中微生物的含量成反比。這樣可迅速進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)，檢測時間隨接種量、繁殖率和代謝類型而變化，但仍比常規(guī)方法要快，一般只需6~ 18h。
九，熒光定量 PCR法
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(簡稱PCR)技術(shù)，自1985 年由美國Cetus公司Mullis等人建立以來，隨著PCR技術(shù)發(fā)展的日趨完善，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、食品衛(wèi)生、醫(yī)療及環(huán)境監(jiān)測等諸多方面。近年來，在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的核酸定量技術(shù)，即實時熒光定量PCR技術(shù)(FQ-PCR)。 自1996年由美國Applied Biosys-tems 公司推出后，由于該技術(shù)不止實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。隨著分子生物學(xué)及其技術(shù)的不斷發(fā)展，實時熒光定量PCR技術(shù)已逐步應(yīng)用于微生物研究領(lǐng)域，使快速準(zhǔn)確的檢測和分析鑒定微生物成為可能。
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